作者：

徐金永（

硕士，主管技师

），刘薇薇，李灵珊，缪秋玲，何潇潇，韩春锡

基金项目

：深圳市科创委课题（

ＪＣＹＪ２０１４０４１６１４１３３１４８７

作者单位：

广东省深圳市儿童医院病理科

肌肉病理学是肌肉病学临床和基础的桥梁，属于临床病理学范畴。

Ｄｕｂｏｗｉｔｚ

是英国近代肌肉病理学的创始人，其制订的研究方法和规范简洁实用。

１９７３

Ｂｒｏｏｋｅ

把新建立的快速冷冻切片酶组织化学染色技术以及电镜技术引入常规肌肉活检研究中。

１９８５

Ｓｅｗｒｙ

Ｆｉｔｚｓｉｍｍｏｎｓ

加入了免疫组化染色技术内容，并选定了一些特异性抗体。早期的肌肉活检将肌肉组织直接固定于

１０％

中性福尔马林中，其后会丧失很多可以检测的信息。现今的肌肉活检技术已经有了非常严格规范的操作程序。本文结合我科实际工作经验，提出提高肌肉活检制片质量的几点建议。

材料与方法

临床送检肌肉标本

１５２

例；美国赛默飞世冷冻切片机；樱花染色封片工作站；恒温水浴箱，迈新

ＭａｘＶｉｓｉｏｎ

免疫组化二抗套装，德国徕卡

Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ

一抗（冻干粉），珠海贝索特染试剂盒（糖原染色、油红

染色），改良

Ｇｏｍｏｒｉｉ

染色、酶组织化学染色（

ＮＡＤＨ

ＳＤＨ

ＣＯＸ

）为自配试剂。

冷冻肌肉包埋块的前期制作

活检的肌肉组织（直径

５ｍｍ

１ｃｍ

左右）固定于软木塞（定制，直径

１～１

５ｃｍ

）上。将肌肉组织立在软木塞上，用加水调制的黄耆树胶固定保证不易倾倒，应注意不要将肌肉组织完全掩埋于黄耆树胶中，暴露适当长度，以不少于

４ｃｍ

为宜。

冷冻肌肉标本包埋块的速冻操作流程

先将气泡较少的异戊烷冷却于液氮（

－１６０℃

）中，再将组织在充分冷却的异戊烷中进行冻结。具体步骤：（

）用细绳在

１００ml

的烧杯颈部系上金属牵绳倒入

７０～８０ml

异戊烷，将烧杯轻轻放入液氮中。（

）用搅拌棒或者长柄枪状镊子不断搅拌异戊烷，使异戊烷冷却均匀，开始时液氮因激烈汽化而冒出白烟，而后会逐渐减少。异戊烷充分冷却后开始在烧杯中产生白色的结晶。（

）长柄枪镊子夹住软木塞，迅速放入低温异戊烷中，向左右迅速而轻柔地晃动。（

）在异戊烷中固定

２０～３０ｓ

后，移入

－２０℃

冰箱中放置

，使组织周围的异戊烷挥发干净。（

）冻结好的组织放入能密封的塑料瓶中避免组织干燥，置于

－８６℃

以下的冰箱中保存。

切片的制作

冷冻切片在恒温冷冻切片机上操作，把

－８６℃

保存的肌肉组织放入

－２５℃

的冷冻切片机内；在金属标本固定底座上滴上

滴水或

ＯＣＴ

冷冻包埋剂，放上带有标本的软木塞，水或

ＯＣＴ

自然分布于软木塞底部，置于恒冷切片机冷冻台上，

３～５ｍｉｎ

后软木塞牢固冻结固定在标本底座上；将恒温冷冻切片机厚度设置调整到

，并调整防卷板至适宜长度；选择锋利的一次性刀片，对标本进行粗修块，直至暴露完整的切面，然后连续切片两轮次，每轮黏附

个切面，用黏附载玻片标贴组织以备染色用。

切片完成后，用手握住冷冻切片机内的金属标本底座（时间不宜过长否则易冻伤）或底座短时浸入装满热水的烧杯中，经过热传导是软木塞和标本底座间的冰溶解，粘有组织的软木塞会脱落。组织块再次放入密封的塑料瓶中，保存

－８６℃

的冰箱中，可反复使用。所有操作均需在

－２５℃

的冷冻切片机中进行。

组织化学染色方法

）苏木精

伊红（

）染色：切片冷甲醇（甲醇置于恒冷切片机中）固定

５ｍｉｎ

水洗后待用：切片置于

Ｈａｒｒｉｓ

苏木精

５ｍｉｎ

；自来水中返蓝

５ｍｉｎ

盐酸乙醇中分化

；再次适当返蓝

５ｍｉｎ

１５～２０ｓ

（或略长）；乙醇梯度快速脱水，二甲苯透明，胶带封固。（

）改良

Ｇｏｍｏｒｉｉ

ＭＧＴ

）染色：

Ｈａｒｒｉｓ

苏木精染色

７ｍｉｎ

，蒸馏水冲洗；

Ｇｏｍｏｒｉｉ

三色染液

２５ｍｉｎ

（直至绿色）；自来水冲洗（如结果过红，可在此步进行

醋酸分化，随后用水冲洗）；梯度乙醇快速脱水，二甲苯透明，胶带封固。（

）糖原过碘酸

Ｓｃｈｉｆｆ

ＰＡＳ

）染色：切片

Ｃａｒｎｏｙ

固定液固定

１０ｍｉｎ

水洗后待用：浸入

过碘酸中氧化

５ｍｉｎ

，蒸馏水冲洗；浸入

Ｓｃｈｉｆｆ

１０～１５ｍｉｎ

，流水冲洗

５～１０ｍｉｎ

Ｍａｙｅｒ

苏木精复染

１ｍｉｎ

；乙醇梯度脱水，二甲苯透明，胶带封固。（

）油红

ＯＲＯ

）染色：

６０％

异丙醇冲洗；

ＯＲＯ

液染色

１５ｍｉｎ

６０％

异丙醇分化，蒸馏水冲洗；

Ｍａｙｅｒ

苏木精复染

１ｍｉｎ

；自来水冲洗返蓝；水性封固剂封固。（

）还原型烟酰胺腺嘌呤二核甘酸脱氢酶

四氮唑还原酶（

ＮＡＤＨ

）染色：将新鲜切片平放于湿盒内，保持空气湿润；滴加孵育液至切片上，确保其完全覆盖，

３７℃

４５ｍｉｎ

，蒸馏水冲洗；水性封固剂封固。（

）琥珀酸脱氢酶（

ＳＤＨ

）染色：切片平放在湿润的环境中，

３７℃

孵育切片

６０ｍｉｎ

；蒸馏水冲洗；水性封固。（

）细胞色素氧化酶（

ＣＯＸ

）染色：新鲜冷冻切片在

３７℃

；蒸馏水快速冲洗；乙醇梯度脱水，二甲苯透明，胶带封固。

１．６Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ

免疫组化染色

免疫组化染色采用

过氧化氢溶液孵育

１０ｍｉｎ×２

次，以消除内源性过氧化物酶的活性，

ＰＢＳ

液浸泡

５ｍｉｎ×３

次；切片置于湿盒内，滴加

５％ＢＳＡ

，恒温

３７℃

２０ｍｉｎ

，甩去多余液体，不洗；擦干组织周围，滴加一抗，室温

冰箱过夜，

ＰＢＳ

５ｍｉｎ×３

次；滴加二抗，恒温

３７℃

２０ｍｉｎ

ＰＢＳ

５ｍｉｎ

次；新鲜配置的

ＤＡＢ

液显色

３～５ｍｉｎ

，镜下观察、控制反应时间，自来水充分冲洗；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，烘片，胶带封片。

２．１ＨＥ

染色结果

细胞核蓝色；肌纤维红色，线粒体暗点；结缔组织粉红色。如果苏木精染色时间长，肌纤维呈过度嗜碱性

染色结果

２．２ＭＧＴ

染色结果

细胞核红色，肌纤维呈蓝绿色，线粒体红色点状；结缔组织呈浅蓝绿色；神经鞘染成颗粒状鲜艳红色

ＭＧＴ

染色结果

２．３ＰＡＳ

染色结果

肌原纤维间的肌质网呈红色或紫色，核呈紫蓝色，

型肌纤维比

型肌纤维着色深，明暗相间排列，肌质膜和毛细血管壁亦呈阳性反应

ＰＡＳ

染色结果

２．４ＯＲＯ

染色结果

ＯＲＯ

染色在肌原纤维间网部位显示橙红色脂肪阳性小滴，

型肌纤维比

型肌纤维着色深，明暗网格状排列

ＯＲＯ

染色结果

２．５ＮＡＤＨ

染色结果

终产物呈蓝灰色，

型纤维活性较高，线粒体聚集区深染。

型纤维最为淡染，

型纤维中等着色，呈明暗“水磨石”外观

ＮＡＤＨ

染色结果

２．６ＳＤＨ

染色结果

终产物蓝灰色，

型纤维活性强，线粒体聚集区高活性。

型纤维最为淡染，

型纤维中等强度着色，呈明暗“水磨石”外观

ＳＤＨ

染色结果

２．７ＣＯＸ

染色结果

细胞色素氧化酶活性区为轻度褐色，

型纤维着色最浓，

型最淡，

型中间色，呈明暗“水磨石”外观

ＣＯＸ

染色结果

２．８Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ

免疫组化染色结果

阳性部位呈

棕色颗粒沉积，肌纤维呈网格状排列

Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ

免疫组化染色，

肌肉活检质量控制与病理科其它技术项目一样，首先需制订严谨、全面的

ＳＯＰ

文件，国内现有北医版和日本版的操作规程可供参考；其次应由熟练的专业病理技术人员操作，开展前预实验，稳定操作方法、规范实验条件、编制工作文件；最后，配制有效工作染液，

ＳＯＰ

是肌肉活检室内质量控制的基础。

肌肉活检质控源头是临床送检的肌肉标本，送检标本应能正确反映肌肉的病变状态，长度不少于

１ｃｍ

，直径不少于

５ｃｍ

。若长度不足难以满足切片的数量；直径过短冷冻制块时肌肉难以直立；若直径足够，可尝试将肌肉分离，制作成

个冷冻块；标本处理前先行大体摄影，记录肉眼所见，以利追溯、总结和查对。若标本不合格应及时通知送检医师，必要时重新取材。工作中常见不理想标本，多为终末期病变肌肉，手术取材困难，相应制片也困难。特殊标本必要时应联系相关医师共同制订制片方案。电镜标本应沿肌束长轴剪取，选用锋利刀具，防止人为挤压，不同位置剪取

条，保证标本质量。冷冻制块应使用专用工具，在通风场所操作，以防窒息。异戊烷使用时间过长含水量增大易形成冰晶，故应标示使用时间，定期更换。肌肉冷冻时，若只静置于异戊烷中，组织周围温度升高，则无法迅速彻底冻结，故应充分搅动，并严格遵照操作时间执行。冷冻组织块制作完成后，置

－２０℃

冰箱中冷冻

，待异戊烷完全挥发后，转移至

－８６℃

冰箱长期冻存。标本保存需选用密封容器，因低温时组织仍发生水分凝华，长时间保存使表层失水，严重时，再次切片周边呈树皮状外观。小空间密闭保存，能有效延缓该现象的出现，延长肌肉保存时效。

标本因无

ＯＣＴ

包绕，切片时需用压片板操作。肌肉标本通常以

厚进行两轮次切片，每轮次裱贴两个切面，利于呈现肌肉的一致性，为染色提供自身对照。为利于切片，可根据组织情况选择不同时间间隔复温后切片：脂肪化严重者应立即切片；外观近正常肌肉者复温至

－２３℃

左右；两者质地之间者放置

１５ｍｉｎ

左右。每张切片裱贴继往接近正常肌肉病例作为对照组织，为染色结果提供评估标准。实际工作中会遇到一类被称为“五花肉”的特殊标本，

染色可见肌束间散在脂肪组织，难以切片，该类肌肉可用纱布沾取液氮速冻后切片，通常制片不理想，可以满足基本诊断需要。

染色操作前依据不同的染色方法应对肌肉切片进行不同染色前处理，并于不同时间间隔后染色。首先固定

染色切片；其次进行

ＯＲＯ

染色，切片空气暴露过久，脂肪组织易发生变化，影响染色。

ＯＲＯ

染色前用

６０％

异丙醇稍浸洗，防止组织杂质黏附染料颗粒影响镜下观察；再次行

上机染色；对

ＰＡＳ

ＭＧＴ

ＮＡＤＨ

ＳＤＨ

ＣＯＸ

及免疫组化染色切片室温干燥固定

１～２ｈ

，如不进行干燥固定，染色中易出现组织与玻片分离现象，镜下呈“蚯蚓状”改变。

染色中苏木精染色时间不易过长，防止肌浆部分细胞器着色影响镜下观察；伊红染色适当延长一些时间，利用低浓度乙醇分化脱伊红作用，更易呈现伊红色彩层次；改良

Ｇｏｍｏｒｉ

染色标志性控制点——肌束间神经纤维断面呈现鲜艳紫红色毛玻璃细颗粒状色彩，核略带紫红色，染色关键在于配方中磷钨酸量控制，量少切片肌纤维呈深绿色，核灰蓝色，量多肌纤维呈浅草绿色，核呈鲜艳红色，标准配方中磷钨酸量在南方区域不适用，呈现量偏少染色偏移，增至

１～２

倍磷钨酸量后呈现较好染色效果。

ＯＲＯ

染色原理为物理吸附，用前新鲜配制，染色效果稳定。

ＮＡＤＨ

ＳＤＨ

ＣＯＸ

染色是一类酶组织化学（

ｅｎｚｙｍｅｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ

ＥＨＣ

）染色，

ＥＨＣ

染色具有特异性，切片不固定，室温放置一定时间后及时染色，室温放置超过

１２ｈ

后许多酶染色不能获得理想染色结果。染色设置阳性对照，过期变质的底物、重氮盐及其它化学溶液均会导致酶显色失败。酶染色试剂不稳定，不易保存，本科室染液采用新鲜配制小包装分装，冻于

－８６℃

冰箱备用（常规

－２０℃

冰箱不能有效保存染液活性）。肌萎缩蛋白免疫组化染色有较强的稳定性，其质量控制类似常规免疫组化质控。

肌肉活检的特点是流程长、环节多、不可控因素多，需要技术人员有很丰富的经验和较强的应变能力。诊断医师需与技术人员密切配合，及时沟通，互相尊重，面对可能出现的各类困难，共同完成高质量的肌肉活检切片。技术人员需要不断深入学习理论知识，认真钻研各种染色原理，总结实践经验，不断提高质量控制水平。

综上所述，肌活检尚有许多技术在该文中未被提及。未来肌肉活检还有着广阔的研究空间，仍需不断的摸索。

参考文献（略）

本文转自《

临床与实验病理学杂志

ＪＣｌｉｎＥｘｐＰａｔｈｏｌ

２０１５Ｏｃｔ

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