点击标题下「蓝色微信名」可快速关注

文章来源：中国小儿急救医学2019,26(10):764-770

作者：刘宇奇黄艳智孙利伟姜洪波田玉玲孟婷玉马岩贺岩赵艳玲马英伟

探讨基于毛细管电泳的多重PCR方法检测小儿呼吸道感染病原效果，为临床及时有效诊断和治疗提供科学依据。

按照"十二五"国家科技重大专项发热呼吸道症候群的监测方案要求定义病例；标本来源为2017年1月至2018年2月长春市儿童医院住院的呼吸道感染患儿的鼻咽拭子、支气管肺泡灌洗液、痰液等。应用一步法多重PCR扩增，然后毛细管电泳分离扩增产物，Genemappersoftware软件分析检测结果。检测病原包括甲型流感病毒(InfA)、人腺病毒(HADV)、博卡病毒(Boca)、人鼻病毒(HRV)、新型InfA-09H1(InfA-09H1)和季节性流感病毒(InfA-H3N2)、副流感病毒(HPIV)、人偏肺病毒(HMPV)、乙型流感病毒(InfB)、肺炎支原体(Mp)、肺炎衣原体(CP)、冠状病毒(HCOV)、人呼吸道合胞病毒(HRSV)。

多重PCR-毛细管电泳有效检测率为95.71%；呼吸道病原阳性检出率为62.84%，混合感染率9.61%，混合感染主要为InfA和HRSV；阳性检出率前3位分别是InfA、HRSV、Mp。不同年龄组检出的病原不同，HRSV阳性检出率0～3岁组明显增高；不同季节检出病原不同，呼吸道病毒感染高发季节为12月至次年3月。2017年1月至3月流感流行季以InfA-09H1为主；2017年11月、12月流感流行季节以InfA-H3N2为主；2017年末2018年初长春地区大范围的流感爆发以InfB为主。HRSV均检出自11月至次年3月份长春地区最寒冷季节。不同感染检出病原不同，HRSV是肺炎患儿最主要的病原，InfA-03H2、HPIV是急性支气管炎患儿的主要病原，HRV、InfA是上呼吸道感染患儿的主要病原。

基于毛细管电泳多重PCR方法检测呼吸道感染病原高效、快速、准确，开发适合临床诊断的试剂，将有广阔的应用前景。

急性呼吸道感染(acuterespiratoryinfection，ARI)是一种常见的感染性疾病，在婴幼儿中具有较高的发病率和病死率

[1]

，给社会和家庭造成严重的经济负担。病毒感染是引发ARI的重要原因，急性病毒性呼吸道感染是发达国家婴幼儿和儿童住院的首位原因，在发展中国家则是主要的死亡原因

[2,3]

。这与病毒颗粒小，容易通过呼吸道传播；病毒容易发生突变，产生新的高致病性突变体；儿童免疫系统发育不成熟有关。近年来除了常规检测的人呼吸道合胞病毒(HRSV)、人腺病毒(HADV)、甲型流感病毒(InfA)等，又有一些新的病毒被发现甚至造成疾病的大规模流行，如人偏肺病毒(HMPV)、新冠状病毒(COV-NL63、COV-HKU1)、博卡病毒(Boca)

[4,5]

。由于这些病毒引起的临床症状、血生化检查、流行特点相似，仅靠临床表现和常规的检测方法很难确定真正的病原体；而且这些病毒又具有感染力强、传播快、混合感染率高等特点，严重威胁小儿的生命健康。此外，肺炎支原体(Mp)和肺炎衣原体(CP)感染在临床表现上也与上述病毒感染相似，因其病原体的特殊性，治疗上与病毒所致感染存在很大不同。基于以上原因，对ARI患儿进行快速、高效、准确的鉴定病原体，为早期临床诊断提供依据，制定治疗方案，具有重要意义。本研究对ARI患儿进行病原检测，在一个反应体系内完成多种病原的扩增，利用毛细管电泳(capillaryelectrophoresis)对扩增产物进行分离、定性分析，作出病原学诊断。该方法涵盖了13种常见的不能培养的呼吸道病毒和非典型的细菌性病原体。检测病原包括InfA、HADV、Boca、HMPV、人鼻病毒(HRV)、新型InfA-09H1和季节性流感病毒(InfA-H3N2)、副流感病毒(HPIV)、乙型流感病毒(InfB)、冠状病毒(HCOV)、HRSV、Mp、CP。检测13种呼吸道病原，改变了以往多病原检测费时费力的状况，减轻了因患儿诊断时间过长而造成的治疗延误。在病原的核酸检测方面东北地区稍落后于南方，长春地区更是缺乏针对ARI患儿多病原检测的统计分析，长春市儿童医院儿童精准医学研究中心率先开展此项检测，为临床科室呼吸道感染病原学诊治提供科学依据。

1材料与方法

1.1病例定义

按照"十二五"国家科技重大专项发热呼吸道症候群的监测方案，本研究中纳入的发热呼吸道病例定义为：(1)急性感染表现(至少符合下列中的一项)：发热；白细胞升高或降低，或白细胞分布异常；寒战；体温降低以及(2)呼吸道临床表现(至少符合下列的一项)：咽部不适、咽干或咽痛；鼻塞、流涕；鼻/咽/喉明显充血、水肿；咳嗽；咳痰；气短；听诊呼吸音异常；胸痛。其中肺炎病例除具有上述(1)和(2)，并具备(3)肺炎症状：X线胸片提示肺部炎性改变。

1.2标本来源

长春市儿童医院作为监测哨点，对符合发热呼吸道症候群监测病例定义的住院患儿进行标本的采集(包括鼻咽拭子、支气管肺泡灌洗液、痰液)。2017年1月至2018年2月共采集156例患儿标本，其中男95例、女61例，男女比例1.59∶1；年龄分布主要集中于<5岁儿童，占全部病例数的47.62%，病例来源均为住院呼吸道感染患儿。

1.3试剂及仪器

核酸提取应用核酸提取试剂盒(宁波市重鼎生物技术有限公司生产)。一步法多重PCR扩增应用宁波市海尔施基因科技有限公司生产的能与毛细管电泳兼容的13种呼吸道病原体多重检测试剂盒，所有试剂均在有效期内。基因扩增仪为美国ABI公司的7500，毛细管电泳为美国ABI公司基因测序仪。基因测序仪所需耗材、甲酰胺进样溶剂及SIZE-500Plus均购自美国AppliedBiosystems公司。

1.4方法

1.4.1核酸提取

按照核酸提取试剂盒操作说明书进行操作，样本及阴性、阳性对照按步骤一并提取核酸。核酸样品最终的洗脱体积为20μl。制备的核酸溶液分装后置于－80℃保存。

1.4.2多重RT-PCR扩增

应用13种呼吸道病原体多重检测试剂盒(宁波海尔施基因科技有限公司)。PCR反应体系包括ResP预混液14μl(15对引物、dNTPs、MgCl

和缓冲液等)、RT-PCR酶1μl(反转录酶、热启动DNA聚合酶、UDG酶、甘油等)，最后加入核酸样本5μl至总体积20μl。RT-PCR程序：25℃5min，50℃15min，95℃2min，94℃30s、65℃～60℃30s，72℃60s，6个循环(1℃降落退火)，94℃30s、60℃30s、72℃60s、29个循环、72℃10min，4℃5min。每一对引物用于检测一个靶基因片段，16对引物除了检测13种呼吸道病原同时还检测人DNA、人RNA和IC内参。

1.4.3毛细电泳

PCR扩增产物经3500基因测序仪进行毛细电泳分离，电泳上样包括甲酰胺进样溶剂9μl、SIZE-500Plus0.25μl、PCR产物1μl。经过毛细管电泳，各个PCR产物根据迁移速率不同被分离。在检测窗口测量标记的PCR产物的荧光强度得到检测数据。

1.4.4实验结果判定

检测数据由ABI公司的"Genemappersoftware"软件进行分析。各病原体对应扩增片段信息如下：InfA102.5nt、HADV112.7/114.7nt、Boca121.1nt、HRV129.5nt、InfA-09H1158.6nt、HPIV179.1nt、CP188.2nt、HMPV199.9nt、InfB207.0nt、Mp212.3nt、InfA-H3N2241.0nt、HCOV261.7nt、HRSV276.7nt，Nt是"Nucleotide"的缩写。待测样品有人RNA、人DNA特征峰，且峰高度高于该毛细管中标准品高峰的，说明样本核酸未明显降解且核酸提取成功。反之则说明取样失败、核酸严重降解或核酸提取失败。IC作为内置PCR内参，监控整个操作流程。若其他特征峰明显，由于竞争扩增原因，IC峰可能降低甚至消失。满足以上条件后再对核酸检测结果峰型图进行判读，比对各个毛细管泳道目的位点峰与该道标准品的高峰和低峰来判定阴阳性。

1.5统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行数据分析。计数资料用例数和百分率(%)表示，两组间差异比较采用卡方检验。

<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1核酸检测结果

163份样本中有7份未检测到人RNA和人DNA，重复实验之后结果同前，考虑核酸降解，排除本试验。156份为有效标本，有效率为95.71%；检测出病原113株，阳性病例98例，阳性检出率为62.82%。阳性率前3位的分别是InfA9.87%、HRSV15.38%、Mp8.33%。混合感染15例，混合感染率9.62%。检出病毒88例，病毒阳性检出率为56.41%；检出Mp13例，Mp阳性检出率8.33%；Mp和病毒混合感染3例，阳性率1.92%；病毒混合感染12例，阳性率7.69%。InfA阳性率19.87%，其中InfA-09H15.13%、InfA-H3N24.49%、其他未分型10.26%；其他病原阳性检出率依次是HRSV15.38%、Mp8.33%、InfB7.05%、HRV7.05%、HADV5.58%、HPIV3.84%、Boca2.56%、HMPV1.92%、HCOV0.64%；CP未检出，见表1。混合感染以HRSV、HADV、InfB与其他病原合并感染居多，最多的类型是HRSV＋InfB(表2)。图1为HRSV＋InfA混合感染毛细管电泳图。

人呼吸道合胞病毒(HRSV)＋甲型流感病毒(InfA)-09H1双重感染毛细管电泳图

2.2各年龄组呼吸道感染患儿病原核酸检出情况

2.2.1各年龄组病原检出情况

0～3岁组呼吸道感染患儿病原检出率前4位的是：HRSV、InfA、InfB和HADV，0～3岁组HRSV阳性检出率明显高于其他年龄段，差异有统计学意义(

＝4.627，

＝0.031)。3～6岁组病原检出率前4位依次是：InfA、HRSV和InfB、Mp。大于6岁组InfA、HRV和HRSV分别居病毒检出率前3位，见表3。

2.2.2Mp感染年龄分布

0～3岁患儿Mp感染3例，大于6岁组比例最高为25.00%；Mp合并病毒感染3～6岁组最多，见表4。

2.3病毒感染时间分布

长春地区儿童呼吸道病毒感染以12月至次年3月为高发期，阳性率为30.9%，2017年4至7月阳性率13.49%，2017年8至11月阳性率为12.69%。HRSV均检出自11月至次年3月长春地区最寒冷季节。InfA-09H1阳性8例，其中7例检出自2017年1至3月，提示2017年1月、2月、3月流感流行季节以InfA-09H1为主。InfA-H3N2阳性7例，5例检出自2017年11至12月，另外2例检出自2017年1月，提示2017年11月、12月流感流行季节以InfA-H3N2为主。其余类型InfA全年散发。InfB阳性11例，10例检出自2017年12月至2018年2月，提示2017年末2018年初长春地区大范围的流感爆发以InfB为主。HAVD冬季4例、夏季3例，春秋两季未检出。HRV全年散发。HPIV、Bcoa、HMPV、HCOV阳性病例较少，未显示出明显的季节特点。见图2、图3。

InfA-09H1、InfA-H3N2、InfA未分型、InfB阳性检出率时间分布图

人呼吸道合胞病毒、人腺病毒阳性检出率时间分布图

2.4Mp感染时间分布

Mp感染全年散发，以冬季稍多(图4)。CP未检测出。

肺炎支原体阳性检出率时间分布图

2.5呼吸道病原在不同感染中的分布

在肺炎患儿中，检出病原前3位分别是HRSV、Mp、InfA，阳性检出率分别为21.59%、13.63%、13.63%。

在急性支气管炎患儿中，检出病原前4位分别是InfA-03H2、HPIV、HADV、Boca，阳性检出率分别为10.26%、10.26%、7.69%、7.69%。在上呼吸道感染患儿中，检出病原前4位分别是HRV、InfA、HRSV、InfB，阳性检出率分别为17.24%、17.24%、10.34%、10.34%。混合感染以肺炎患儿居多。见表5。

3讨论

传统的呼吸道病原检测方法有病毒分离培养、直接荧光抗体法，以及目前常规应用的PCR方法等。病毒培养法虽然特异性良好，但传统的病毒培养方法存在周期长、运输及存贮过程中不易保持病毒感染性等问题，很难用于临床早期诊断和指导治疗，而且一些病毒培养条件苛刻甚至不能培养。直接荧光抗体法虽然快速但需要专业的技术人员、特异性的抗体等；另外，直接荧光抗体法还会受到新发病毒特异性单克隆抗体的制约，对于多病毒检测应用有限。随着分子生物学的进步，PCR技术的发展为呼吸道病原的鉴定与分型提供了新的选择。但是对于未知病原体感染及多病原的混合感染，常规PCR方法往往需要进行多次扩增筛选，相对费时、费力。多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR技术，能够同时扩增出多条目的DNA片段，从而实现多病原体的快速鉴别和诊断，降低检验成本。

毛细管电泳是指以高压电场作为驱动力，以毛细管为分离通道，按样品各组分淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。与传统的平板电泳方法相比，毛细管电泳具有分离效率高、样本用量少、分析速度快、重现性好、自动化程度高等特点。

本研究以儿童ARI常见的13种病毒和非典型细菌的高度保守序列为靶区域，在一个反应体系中同时扩增多种不同的DNA序列；采用毛细管电泳方法对不同片段大小的PCR扩增产物进行分离，得到病原体的检测结果；通过同时对样品中的人RNA和人DNA进行检测，对样品质量进行监控，有效避免了假阴性的结果；RT-PCR内参用于对核酸提取、RT-PCR和毛细管电泳等整个检测过程进行监控。整个试验过程耗时短、时效性好，4h之内就可以完成8个样本的检测，可同时检测192个样本；检测项目全面，涵盖儿童ARI常见的病毒、Mp、CP，有助于提高呼吸道多病原感染患儿的实验室检测水平，满足大规模样本的多病原检测。Li等

[6]

为了对比该方法，应用了另外两种多重PCR方法对所有的样本进行病原学的检测。在病毒检测方面与Luminex公司的xTAGReapiratoryViralPanel(RVP)快速诊断试剂盒进行比较；对于非典型细菌的检测则与SeeplexPneumoBacterACEDetectionKit琼脂糖电泳方法进行比较；最后对所有阳性标本的扩增产物进行测序以验证试验结果。结果表明无论在单一病原感染还是多病原感染的病原学诊断方面，基于毛细管电泳的多重PCR方法的灵敏度和特异度均优于其他两种方法；该方法检测13种呼吸道病原灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别达到97.31%、100%、100%和99.85%。这是目前该方法第一次用于儿童ARI的病原学检测。

本研究中呼吸道病原阳性检出率依次为：InfA(包括未分型、09H1、H3N2)、HRSV、Mp、InfB、HRV、HADV、HPIV、Bcoa、HMPV、HCOV，国内针对ARI多同时检测7种常见病毒，未见针对13种呼吸道病原的报道。流感病毒属正黏病毒科，其基因组为分节段的单股负链RNA。按照M蛋白和NP蛋白的特征，流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)型，其中甲型流感病毒除了感染人外，还可感染禽、猪、马等动物。根据甲型流感病毒包膜上的血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)抗原性差异，甲型流感病毒又可进一步分为不同的亚型。目前研究显示HA有16种(H1～H16)亚型，NA有9种(N1～N9)亚型

[7,8]

。由于甲型流感HA和NA极具变异性，因此在以往的流感流行中主要以甲型流感为主。国家CDC的监测资料显示，中国大陆的流感具有两种活动模式，其中南方地区流感高峰多出现在每年的6～8月份，北方地区流感高峰出现在每年的12月份至次年1月份

[9]

。本研究提示，2017年1月、2月、3月流感流行季节以InfA-09H1为主；2017年11月、12月流感流行季节以InfA-H3N2为主；在InfA-H3N2流行之后的2017年末、2018年初长春地区大范围的流感爆发以InfB主；而未分型InfA全年散发。以上检测结果的季节分布特点与北京地区报道一致

[10]

。Zhang等

[11]

报道，在温带气候地区，HRSV的致病性在寒冷干燥低温的环境中达到高峰。我们的研究中HRSV均检出自长春地区最寒冷季节，与Zhang等

[11]

、谢菲等

[12]

报道一致。儿童HADV感染具有明显的季节特点，北方以冬春季节高发，南方以春夏季为感染高峰

[13,14,15]

。本研究HADV阳性患儿冬季4例、夏季3例，春秋两季未检出，考虑与入组患儿较少，故季节倾向性不十分明显有关。HRV在呼吸道标本中检出率较高，是不同地区常见的呼吸道病原，在董泽丰等

[16]

的报道中成都地区HRV阳性检出率高达24.62%，明显高于本研究结果，不同地区检测结果的差异可能是由于病例类型、检测方法等不同引起，也可能是由地区差异造成的。本研究中HRV全年散发，未显示出明显的季节性，与董泽丰等

[16]

报道不同。Mp感染全年散发，冬季阳性检出率略高。HPIV、Bcoa、HMPV、HCOV阳性病例较少，未显示出明显的季节特点。

总体来说，长春地区儿童呼吸道病毒感染以12月至次年3月份为高发期。分析原因冬季寒冷的天气使呼吸道毛细血管痉挛、缺血，局部抵抗力减弱，黏膜上皮的纤毛变短、黏连、运动减弱，清理运动障碍，有利于病毒的繁殖。而夏季干燥的气候能够干扰含有病毒的气溶胶的传播，而且夏季紫外线强度大，可以灭活病毒，使其失去传染性。相反，在冬春季节外界低温可以提高病毒在气溶胶中的稳定性，延长病毒在外界环境中生存时间，从而增加了感染的机会。

此外，长春地区呼吸道感染患儿非细菌性病原体流行与年龄有关，0～3岁呼吸道感染患儿病原体检出率前4位是HRSV、InfA、InfB和HADV。3～6岁呼吸道感染患儿病原体检出率前4位是InfA、HRSV和InfB、Mp。6岁以上患儿InfA、Mp和HRV居病原检出率前3位。有研究显示，HRSV是引起儿童下呼吸道感染的首要病原体

[17]

，本研究中HRSV是除InfA以外的阳性检出率最高的病毒，是婴幼儿呼吸道感染的主要病原体，与谢菲等

[12]

、吴茜等

[13]

报道一致。InfA在学龄前儿童和学龄儿童中检出率增高考虑与患儿活动范围增加，与外界接触机会增多有关。Mp主要经飞沫感染，大多发生于夏末秋初，但一年中任何时间都可发生，发病率以5～15岁的青少年居多。本研究中Mp随着年龄增长阳性检出率逐渐增高，主要感染年长儿童，与国外报道一致

[18]

。HADV检出率随年龄增长逐渐降低，与北京地区报道一致

[19]

，与苏州地区报道不同

[14]

。另外HPIV、HMPV、Bcoa均检出自3岁以内幼儿，1例HCOV阳性患儿也是小于6岁，考虑与婴幼儿期儿童的机体免疫功能较低，体液免疫还未发育完全，感染呼吸道病毒的可能性增大有关。

呼吸道病原在不同的感染中分布也不同。在肺炎患儿中，检出病原前3位分别是HRSV(21.59%)、Mp(13.63%)、InfA(13.63%)。乔瑞娟等

[17]

报道儿童感染HRSV后，50%患儿会发展为下呼吸道感染，表现为咳嗽、咳痰、发热和呼吸困难等，是导致儿童肺炎的主要病原体，与我们的研究一致。在急性支气管炎患儿中，检出病原前4位分别是InfA-03H2、HPIV、HADV、Boca。在上呼吸道感染患儿中，检出病原前4位分别是HRV、InfA、HRSV、InfB。多病原混合感染以肺炎患儿居多。

ARI是儿科最常见疾病，呼吸道病原学的分析研究对儿童呼吸道感染的临床诊断与治疗具有重要意义

[20]

。早期进行病原学诊断，才能有的放矢地进行治疗，而多病原共感染、病毒变异、新病毒的出现，都是呼吸道病原检测技术面临的巨大挑战。基于毛细管电泳多重PCR方法可高效、快速、准确检测多种病原，开发基于毛细管电泳多重PCR方法的呼吸道感染病原检测试剂，将有广阔的应用前景。

参考文献（略）

版权申明: 本站文章来源于网络或网友自行上传，如果有侵权行为请联系站长及时删除。