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指南解读

《儿童呼吸道感染微生物检验标本采集转运与检测建议（病毒篇）》解读

张海邻，李昌崇

中国实用儿科杂志2019Vol.34（2）：89-93

病毒是儿童呼吸道感染的主要病原，由于临床表现各异，病原学检测非常重要。由于种种原因，呼吸道感染微生物检验标本的采集、处理、转运等常成为整个检验过程中最薄弱的环节，临床医师对常用的呼吸道病毒检测方法和临床价值也缺乏足够的了解。该文围绕《儿童呼吸道感染微生物检验标本采集转运与检测建议（病毒篇）》，就标本采集的重要性和存在的问题、呼吸道病毒检测方法和结果判读中需要注意的问题等展开讨论。

关键词

儿童；呼吸道感染；病毒；标本检测

作者单位：温州医科大学附属第二医院育英儿童医院呼吸科，浙江温州325027

通讯作者：张海邻，电子信箱：zhlwz97@hotmail.com

病毒不仅是儿童上呼吸道感染的主要病原，也是社区获得性肺炎的重要病原［1］，一项对192个国家的儿童肺炎流行病学的荟萃分析显示，发达国家每年每人发生肺炎0.015次，而低中收入国家则是0.22次，呼吸道合胞病毒是最常见的病原体（28.8%），流感病毒次之（17.0%）［2］。美国一项纳入2222例0～17岁儿童社区获得性肺炎的病原学研究发现，病毒病原占73%，其中居前3位的分别是呼吸道合胞病毒（28%）、鼻病毒（27%）和偏肺病毒（13%）［3］。而Ning等报道，病毒同样是我国儿童社区获得性肺炎的主要病原，其中鼻病毒（20.3%）和呼吸道合胞病毒（17.3%）分居前两位［4］。除了社区获得性肺炎，病毒在毛细支气管炎中的地位更加突出，高达50%～80%的毛细支气管炎患儿为呼吸道合胞病毒感染，其次为鼻病毒、副流感病毒等［4］。

病毒性呼吸道感染可见于各个年龄段，婴幼儿常见。患儿可有发热、咳嗽等临床表现，体温一般在38.5℃以下，偶有高热，累及下呼吸道时常有喘息，严重者可有胸壁凹陷、口周发绀、鼻翼扇动等症状。不同病毒所致的临床表现不尽相同，鼻病毒感染常以鼻塞、流涕、咽痛等上呼吸道症状为主要表现，也可以有咳嗽、喘息等下呼吸道感染的症状，一旦累及下呼吸道，临床难以和呼吸道合胞病毒鉴别。流感病毒感染的全身症状较为突出，常有高热、肌肉酸痛、全身乏力，年幼儿童或有基础疾病者则很容易发展为肺炎，且常常病情严重。年长儿腺病毒感染常表现为“咽结合膜热”，而年幼儿则多进展为肺炎，高热、喘憋明显，部分则会遗留呼吸系统后遗症。因此，病毒性呼吸道感染的病原学检测非常重要。由于种种原因，临床微生物标本的采集、处理、转运等常成为整个检验过程中最薄弱的环节。此外，随着呼吸道病原微生物检测手段的不断发展，临床医生也需要对常用的检测方法和临床价值有进一步了解。为此，中华医学会儿科学分会呼吸学组呼吸道感染协作组与《中国实用儿科杂志》编辑委员会组织儿科和临床检验等领域专家撰写了《儿童呼吸道感染微生物检验标本采集转运与检测建议（病毒篇）》［5］，以期为儿科医护人员的临床工作提供指导。本文就该文的若干内容进行进一步解读。

1标本采集的重要性和存在的问题

1.1标本采集的重要性目前有70%～80%的临床诊断和病情评估需要实验室检测结果来辅助。获得准确可靠的检验结果依赖于分析前、分析中和分析后的质量控制，通常分析前阶段所用时间约占整个分析过程的57%，发生在分析前的误差占整个分析过程误差的70%以上［6］。分析前阶段按时间顺序，从临床医生提出检验申请，到分析检验程序启动时终止的步骤，包括检验申请、患者准备、原始样品的采集、标本运送到实验室并在实验室内进行传输［7］。正确规范地采集合格的标本是分析前质量控制的重要环节。适当的标本管理对患者诊疗有决定性的影响，它是实验室准确诊断的前提，可以影响治疗决策，影响医院感染控制，影响患者住院时间、住院费用和实验室费用等。低质量标本会影响检验结果的准确性，不准确的检验结果会影响医院向患者提供最佳诊疗效果的能力。任何一个退回的检验标本，不仅会导致治疗时间的延误，还会造成再次采集标本的困难，进而影响到患者的信任，材料成本及人力成本也跟着增加，所以要强调分析前质量控制管理，提高标本的质量。

1.2标本采集的相关问题呼吸道标本是临床微生物实验室接收到的最常见的标本，但此类标本的采集和送检存在诸多不规范之处，影响了呼吸道感染病原的诊断。微生物学标本的选择和收集是由医护人员而不是实验室来完成的，因此，临床医护人员应知晓微生物标本采集和运送要求，协助实验室提供准确、有临床意义的结果［8］。

呼吸道标本主要包括口咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽吸取物、痰液、气管吸取物、支气管肺泡灌洗液等。目前，临床微生物室接收最多的标本是痰细菌培养，然而痰标本并不是诊断细菌性肺炎的最佳标本，痰标本在某种程度上都有口咽部正常菌群的污染［9］。由于儿童很难咳出合格的痰液，痰同样不是儿童呼吸道病毒感染检测的最佳标本。多数呼吸道病毒的主要复制部位为后鼻咽部纤毛柱状上皮细胞，其次为前鼻孔和口咽部纤毛上皮细胞，因此可用咽拭子代替痰液，且鼻咽拭子的病原检出率较口咽拭子高［10］。鼻咽吸取物较咽拭子有更高的阳性检出率，可用于病毒核酸和病毒抗原检测，是＜2岁儿童的首选［11］。目前，上呼吸道病毒对下呼吸道样本究竟有何种影响尚无确切的定论，下呼吸道微生物的检测仍面临着许多挑战。

目前呼吸道微生物标本采集基本上都是一线的低年资医生和护士在操作，有些科室甚至由进修或实习人员操作。由于实验室和临床科室的交流、沟通不够，岗前技术培训不到位，使操作者对临床微生物标本的采集要求和注意事项不甚了解，可能导致标本不合格，误导临床诊断和治疗。比如采集痰液标本，有医护人员对需负压吸引留取痰标本的患者，采用1mL注射器留痰标本，或者采用棉签从吸痰管取痰。医护人员必须要清楚，采集鼻咽拭子、口咽拭子中，只能采用无菌的聚酯纤维或人造纤维制成的塑料柄拭子，不能使用藻酸钙拭子或木棒拭子，因为其可能含有灭活某些病毒和抑制PCR检测的物质［10］。拭子条应使用可吸附更多生物样本并可达到较高释放率的植绒拭子，棉拭子可能含有对细胞培养有害的物质，且常不能采集到足够量的脱落细胞，不适用于鼻咽或口咽部分泌物的采集［12］。

微生物标本保存的要求取决于选择的检验项目。对于病毒培养的检验项目，需维持微生物的活力、防止非致病菌污染和过度繁殖；核酸检验尤其是RNA易受RNA酶降解，须使用经高压灭菌或经RNase酶清除处理过的无RNase酶的一次性耗材。

1.3标本采集的规范要求临床医护人员要认识到，实验室有权利拒绝接受不合格的标本。对不合格标本，实验室也有义务通知临床重新采集标本。微生物标本采集涉及到医生、护士、进修实习生等人员。医院相关管理部门要与检验科及临床医护人员沟通，制定切合各医院实际、有科学性、易学易懂的标本采集标准操作规程。每个操作规程内容包括标本采集的目的、采集前的准备、具体的采集方法、标本保存运送方法等。同时加强对低年资医生、护士、进修医生、实习生进行标本采集标准操作流程的岗前培训，对重点部门直接深入科室利用科会、晨会等时间进行专项培训，必要时给予现场操作指导，纠正错误。实验室发现不合格的标本后应及时反馈到科室，为下一步采取针对性的改进措施提供依据。医护人员应加强和检验科的联系，经常就标本采集、运送等相关问题进行沟通交流，保证标准操作规程得到遵守和落实，不断提高微生物标本采集技术，确保检验结果的准确性和有效性。

2呼吸道病毒检测方法选择和结果判读需要注意的问题

2.1呼吸道病毒检测方法的选择传统的病毒分离是通过体外培养实现的。在20世纪70年代之前，这种方法是大多数诊断实验室的标准操作方法，也被认作是病毒检测的“金标准”。近年来，经过改良的细胞培养技术使培养时间从5～10d减少到了24h，使用组合细胞株的小瓶培养法（shellvialassay）还能同时检测多种呼吸道病毒［13］。然而培养法的样本运输和保存的条件较高，部分和临床相关的病毒难以在培养法中生长（例如鼻病毒和冠状病毒），限制了病毒培养的临床应用［14］。电子显微镜也是用于临床病毒诊断的直接检验方法，在辨别新发传染病的病毒病原方面发挥了重要作用，例如与严重急性呼吸综合征（SARS）有关的冠状病毒就是通过电子显微镜发现的，但是它同样需要特定的设备，操作复杂，技术要求高，很少用于临床上呼吸道病毒的检测。病原特异性抗体一般会在感染后2周内出现并被检测到。血清能够检测大多数呼吸道病毒的抗体，例如呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A和B、副流感病毒1～3型等，但是与分子生物学方法相比，血清检测的敏感度较低，而且婴幼儿对抗体的反应较弱，限制了血清学检测在呼吸道病毒检测中的应用。

呼吸道病毒的抗原检测在临床广泛应用，其基本原理为病毒抗原和特异性抗体相互结合，快速检测临床标本中的病毒抗原。根据抗体标记物的不同，有直接或间接免疫荧光法、放射免疫法、酶联免疫法、胶体金免疫分析、免疫层析法等。直接免疫荧光法是通过荧光素直接标记特异性抗体来检测相应的病原体，因此，不同的病毒检测需要制备相应的荧光抗体，较间接免疫荧光法的成本高，但减少了二抗可能导致的非特异性反应，提高了特异度［15］。但是抗原检测需要采集到足够量的呼吸道上皮细胞，多选择鼻咽和气管吸取物、肺泡灌洗液标本，由于咽拭子获取的细胞数较少，不适用于免疫荧光法检测。核酸检测的敏感度较高，临床采集的咽拭子、吸取物、肺泡灌洗液或痰液均可用于检测，加上其快速、简便、高通量的优势，已成为诊断呼吸道病毒感染的主要方法。呼吸道病毒的核酸检测方法包括环介导等温扩增技术（LAMP）、依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）、转录介导的扩增技术（TMA），链置换扩增技术（SDA）、基因芯片技术等，最常用的还是聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）。实时定量PCR技术临床应用较为广泛，具有自动化、速度快、精确度和分辨率高、可分析病毒载量等优点，可更好地评估感染时机，用于治疗监测。随着多重PCR技术的普及和推广，国外基于该技术的多种呼吸道病毒检测试剂盒越来越多，国内亦有基于毛细电泳先进片段分析的多重PCR试剂盒通过国家药品监督管理局的注册上市。与其他以核酸为基础的分子方法相比，虽然多重PCR技术的敏感度和特异度可能会针对个别目标有所不同，但总体检测结果令人满意［16］。一项对NxTAG呼吸道病原检测的研究显示，除了肠病毒或者鼻病毒（94%），其他病原学检测的特异度均＞99%，敏感度在83%～100%之间［17］。我们采用基于先进片段分析技术的多重PCR检测儿童下呼吸道感染的病毒病原，病原检出率和Luminex呼吸道病毒液态芯片技术一致［18］。多重PCR与多个单引物PCR相比，对样本量的要求较低，且具有更高的性价比（通量大、试剂价格低、节约人工、检测时间短），临床应用前景广阔。但是，针对不同病原体的多个不同引物同时进行扩增时扩增效率的不一致性是限制其应用的主要技术难点，需对引物及反应条件进行优化，以提高其覆盖度和可靠性。

新技术的开发和引进为呼吸道病毒检测提供了更多的选择。二代测序（nextgenerationsequencing，NGS）技术的发展为呼吸道微生物检测带来了重大变革［19］。NGS较第一代测序技术速度更快、花费低、数据量大，能在一次测序中同时测定许多病原体的保守基因序列，展示呼吸道样本中包括细菌、病毒、真菌等在内的整个微生物群落的基因组构成。Graf等［20］发现，使用儿童鼻咽拭子标本检测，NGS方法与多重PCR检测试剂盒有较高的一致性，并且能够检测出更多的病毒。NGS有助于揭示医院相关的病原传播特征，制定儿科病毒病原暴发时的控制策略［21］。但是高耗费和测序数据分析的复杂性限制了诊断性NGS的广泛使用，确定临床NGS检测的适应证，对临床医生会有更大的帮助。

近年来，床旁检测技术（point-of-caretesting，POCT）逐渐应用于呼吸道病毒检测。胶体金免疫分析和免疫层析法检测呼吸道病毒抗原操作简单、快速，不需要特殊设备，可实现床旁检测。基于核酸扩增技术的分子POCT在呼吸道病毒诊断领域也有新的进展。分子POCT的报告时间短（＜30min），需要手工操作的时间也很短（1～2min），即使是非实验室专业人员也很容易操作［22］。美国食品药品监督管理局批准的分子POCT测试多数针对流感病毒A和B及呼吸道合胞病毒，评估发现检测上述病毒有高敏感度（87%～100%）和特异度（＞98%）［15］。但是分子POCT检测较昂贵，易于污染，而且如果操作人员没有经过正规训练，不完善的质量控制将会影响结果的准确性［23］。此外，POCT的临床价值尚需进一步证实，POCT是否能减少抗菌药物的使用或缩短住院时间，尚需进一步积累证据［24］。

2.2客观看待检测结果呼吸道病毒抗原检测广泛使用，该方法的特异度较好，阳性提示活动性病毒感染，但灵敏度较低，需要采集到足够量的呼吸道上皮细胞，因此，阴性不能排除相关的病毒感染，此外污染的黏液可产生非特异性荧光，需要经验丰富的实验技术人员进行判断。

尽管并不推荐呼吸道病毒感染的血清学检测，但在基层仍在普遍应用。通常情况下，IgM在初次感染后的几天内出现，7～10d达到高峰，因此，单份血清标本IgM阳性提示有急性感染可能，但是部分患儿的IgM会持续2～3个月。IgG在IgM产生后几日内出现，到达比IgM更高的水平，并逐渐下降在一个略低的水平持续数年甚至终生。因此，急性期和恢复期血清抗体水平显著升高（4倍或者更高）的临床价值更大。

分子生物学已成为呼吸道病毒最重要的检测手段，被视作新的“标准诊断方法”［15］。但有些问题需要引起临床医生的关注。首先，在部分无症状感染者中也可检测到病毒核酸，核酸检测仅提示有感染，不一定致病，也不一定是现症的感染，若能结合动态变化和病毒载量测定，临床意义更大；其次，由于标本收集的原因，目前大多数的研究采用了鼻咽吸取物或鼻咽拭子等上呼吸道标本，由于上呼吸道和下呼吸道的微环境不同，不同的呼吸道病毒也有不同趋向性［25］，上呼吸道检测结果是否真正反映下呼吸道尚需进一步研究。即使都是下呼吸道的样本，Willner等［26］证实不同肺叶内的病毒也存在空间异质性，这进一步增加了临床判断的复杂性。此外，多重PCR的普及发现病毒混合感染的比例很高，混合感染的临床价值也需要进一步评价［18］。

综上所述，儿童呼吸道病毒感染性疾病常见，在病毒病原诊断中，一线医护人员要严格遵循采集规范，从标本的采集、处理、转运和保存各环节做起，保证检验前环节的质量控制。要根据医院规模、病人情况和检测目的、实验室条件、费用等多种因素选择合适的呼吸道病毒检测方法，并结合临床实际对检测结果进行客观的分析。

参考文献(略)

2018-12-20收稿）

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