XavierMJ,Salas-HuetosA,OudMS,AstonKI,VeltmanJA.Diseasegenediscoveryinmaleinfertility:past,presentandfuture.HumGenet.2021;140(1):7-19.

有效的鉴定导致男性不育的基因可提高对疾病的生物学理解，亦可提高基因检测的诊断率与临床相关性。虽然目前对于精子质量缺陷相关基因领域研究取得了重大进展，但在精子数量缺陷的遗传学方面情况并非如此。基因组学的技术进步和研究方法对于疾病基因鉴定过程至关重要。本周为大家介绍的这篇综述主要分析了过去、现在、未来不同的技术发展如何提高对男性不育遗传学的理解，以及对相关基因发现和功能验证的影响，尤其是使用无偏倚基因组学方法、日益相关功能分析的发展、以及大规模国际合作对促进男性不育相关基因鉴定的重要性。详细阐述了当前的缺点和挑战，并对未来的发展方向提出了一些看法，呼吁研究者、临床医生和患者加强合作以及信息共享，造福更多患者。

不孕症是一种复杂的病理状态，影响全球近7%的男性，表现为多种异质性表型，可表现为先天性或后天性泌尿生殖系统异常、内分泌紊乱和免疫因素，或为生精数量和质量缺陷。

虽然严重的不育症不能直接遗传（除非借助辅助生殖技术，在默认情况下受影响的男性无法自然传递其遗传信息），但未受影响的父母可以遗传基因突变，导致后代发生常染色体隐性或X连锁形式的男性不育。此外，许多突变事件发生在正常配子形成期间，导致种系新生突变(DNMs)、新生拷贝数变异(CNVs)或新生染色体异常，其中一些疾病可致后代男性不育。

在大约15%的不育男性中，遗传缺陷最有可能是产生不育的根本病理原因。然而尽管核型分析、无精症因子（AZF）缺失筛查和囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTR）突变分析得到了广泛应用，但最近有研究表明针对大量未经检测的患者队列研究提示

只有4%的男性不育患者进行了病因学基因诊断。

与其他疾病类似，遗传学在重度生精功能障碍中发挥了更突出的作用，如严重少精症(<每毫升500万个精子）或无精症（射精时无精子）。

对男性不育的遗传学研究始于二十世纪中叶，直至今天在新的分子技术和技术进步的推动下，人类男性不育症各种亚型的关键基因得以发现和描述。20世纪50年代首次报道了男性不育遗传原因的证据，在诊断为Klinefelter综合征患者中发现了一条额外的X染色体，但直到20世纪90年代末才加强了相关研究工作寻找其他的遗传因素。最初的研究集中在雄激素受体（AR）和CFTR基因的特异性缺失和突变，以及Y染色体异常。近年来，研究人员越来越多的使用全基因组染色体微阵列以及最近的下一代测序(NGS)技术对男性不育症进行基因组研究，识别男性不育症基因。

图发现男性不育关键基因的时间表

过去：染色体研究和特定基因分析首次揭示了男性不育基因

1、染色

体异常致男性不育

染色体核型分析检测最早应用于研究不育的男性是否存在遗传异常，至今仍在男性不育中使用为最广泛。

染色体核型分析揭示了一些与男性不育相关的非常重要的染色体异常，其中最常见的是Klinefelter综合征，其特征是存在额外的X染色体(47,XXY)，有15%的非阻塞性无精症患者携带此变异。染色体核型分析与荧光原位杂交（FISH）结合可发现其他导致原发性不孕和性发育障碍的染色体异常，特别是46,XX男性、罗伯逊易位和相互易位。

核型分析提示的位置对于确定控制正常精子发生的遗传因素也很重要。1976年，通过核型分析在6名无精症患者中发现Yq11远端缺失，并将此区域确定为精子发生所必需的区域。尽管这表明在Y染色体的缺失部分存在一个或多个控制人类精子发生的基因，但直到20世纪90年代，第一个直接参与精子发生失败的基因才被新的分子技术鉴定出来。

在Y染色体的缺失区域内寻找无精症因子（AZF）涉及使用聚合酶链反应（PCR）分析和Y-特异序列标记位点（STS）来识别潜在候选基因。其中，无精子症缺失基因（DeletedinAzoospermia，DAZ）是最强的候选基因，目前已鉴定4个DAZ同源基因（DAZ1-4）。基于PCR的技术的使用进一步揭示了在生精失败的男性患者中Y染色体上经常发生缺失的基因组区域AZF区域a、b和c。每个区域都包含在睾丸中高度表达或特异表达的与精子发生相关的候选基因，包括BPY2、CDY、DAZ、HSFY、RBMY、PRY、TSPY、VCY和XKRY等。AZF区域微缺失可引起2-10%的不育男性表现为可变的少精到无精表型。

然而大多数男性不育的遗传原因仍然未知。

2、特定基因突变致男性不育

1988年通过X染色体连锁分析定位小鼠雄激素受体基因突变已被证实可导致小鼠睾丸女性化，是除Y染色体以外在X染色体上发现了第一个与男性不育相关的基因。Brown等使用基于PCR结合Southern杂交的方法揭示了人类雄激素受体（AR，也称为NR3C4）的缺失为轻度或部分雄激素不敏感综合征患者不孕的原因，以及完全雄激素不敏感综合征患者性逆转的原因。使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)、单链构象多态性分析(SSCP)以及变性高效液相色谱(DHPLC)等技术对AR基因PCR扩增的外显子进行突变筛选。目前已在2%的不育男性中发现了可致轻度或部分雄激素不敏感综合征的AR基因突变。

1989年，使用限制性片段长度多态性（RFLP）分析结合PCR测序的方法，在7号染色体上鉴定出CFTR基因（囊性纤维化跨膜电导调节器）突变是囊性纤维化致病的基础。自报道以来，进一步的研究表明CFTR基因中特异性突变可导致孤立性不育。特别是利用DGGE和SSCP技术发现CFTR突变可导致先天性双侧输精管缺如导致的阻塞性无精症。CFTR基因突变在全球人群中携带率较高，特别是在欧洲后裔中，每25人中就有1人是致病性变异的携带者，这是其导致60-70%先天性输精管缺如(CAVD)的原因。然而总的来说CAVDs是仅在1-2%的不育男性中发现的一种罕见性疾病。

随着测序技术的优化和升级，可在自动化DNA测序仪上进行Sanger测序，使DNA测序在21世纪初广泛应用于人类疾病研究和诊断。特别是通过定位克隆或模式生物中同源基因的研究成功的鉴定出候选疾病的基因突变。一个很好的例子就是在精子发生过程中发现了与减数分裂阻滞相关的SYCP3基因突变，该基因在雄性不育中的作用先前已在小鼠模型中得到证实，携带SYCP3基因纯合突变的小鼠在精子发生过程中因大量凋亡细胞丢失而不育。在分离出人类SYCP3基因后发现其具有相同的功能，如果被破坏对人类生育能力也有类似的负面影响。虽然在小鼠中双等位基因突变引起不育表型，但人类的SYCP3基因单一杂合突变足以损害精子发生。

当前：技术进步可无偏倚进行不育基因组研究

1、利用微卫星扫描和SNP微阵列进行全基因组纯合性筛查

20世纪90年代对现有测序技术的改进以及单核苷酸多态性（SNP）微阵列的引入，使得可用于研究男性不育基因组，以及识别与男性不育相关的新基因的研究方法再次发生转变。最初这项工作的重点是开发和应用大量的多态性标记筛选近亲血统不育男性基因组中的纯合性区域。2007年使用这种定位克隆方法新发现两个的男性不育基因AURKC和SPATA16，可导致多种形态精子异常，也在精子鞭毛形态异常的不育男性中鉴定出DNAH1纯合变异。

2、基于染色体微阵列的基因组拷贝数变异检测

Y染色体上存在的CNV等结构变异已明确表明对精子发生存在负面影响，只有少数其他结构基因组变异与男性不育密切相关。

自90年代后期以来，基于微阵列的比较基因组杂交（arrayCGH）和SNP阵列显著提高了基因组缺失和重复的检测分辨率。

2011年应用SNP芯片技术发现了一个与男性不育相关的重要CNV，即DPY19L2基因的200kb纯合缺失。起初因DPY19L2的特异性扩增和假基因对测序的干扰未能检测出变异，2012年Coutton等优化了特异性扩增和测序的条件，在2名球形精子症患者身上鉴定出一例携带一个基因缺失和无义或错义突变的复合杂合突变，一例携带纯合错义突变。目前大多数球形精子症病例可鉴定出同时携带DPY19L2基因缺失和点突变。

2011年，Tüttelmann等利用微阵列技术三个无精或少精患者中发现罕见的性染色体CNV变异。近期Yatsenko等使用高分辨率array-CGH识别了两名无精症患携带相同的X染色体TEX11基因三个外显子缺失。该基因Sanger测序结果提示其他无精症患者中存在其他致病性（截断和剪接）突变。同年另一研究组也报道了无精症患者的TEX11突变，决定研究TEX11基因是因为他们之前的研究表明缺乏该基因的雄性小鼠表现出减数分裂停滞而致无精症。使用类似的微阵列方法，位于9号染色体的DMRT1基因缺失也被报道跟无精子症相关。虽然DMRT1基因确定与无精症相关，但其在不育中的作用机理仍不完全清楚。其他罕见CNV的临床相关性因CNV报告的病例数量有限（甚至只有1例）尚不确定，如2014年报告了在一名无精症患者约1MB缺失，在11号染色体上发现的CNV跨越9个基因，其中WT1基因被认为是导致生精失败的潜在原因。另一个例子是迄今为止仅在地中海地区无精症男性中观察到的X染色体上11–15kb的缺失，导致MAGEA9B基因近端拷贝的部分缺失。

虽然SNP和CGH微阵列突出了CNV在男性不育中的重要作用，但目前下一代测序（NGS）的广泛应用提供了同时检测CNVs、其他更复杂结构变异、SNVs的机会。最近在一例严重少精症患者中报道了一种影响SYCP2基因的平衡易位，该易位最初通过核型分析发现，后面通过微阵列和NGS进一步验证。通过国际合作，在另外三名来自德国不育症的患者中发现了影响SYCP2基因的功能缺失突变，突出了结合结构基因组变异和单核苷酸变异分析以及多机构合作的重要性。

3、检测新疾病基因的下一代测序

过去十年中，高通量NGS平台的发展使得测序成本大幅下降，同时测序通量也大幅增加。NGS允许对大量基因、所有编码外显子（全外显子组测序）或整个人类基因组进行无偏倚测序，避免了依赖于选择单个候选基因测序或在少数患者与对照组对比评估的缺陷，并且NGS测序越来越多的在大量患者和对照组中进行。因此，

NGS为发现新的疾病相关基因提供了一种廉价、快速的基因筛查方法。

下图展示了近年来外显子组测序如何成为用于男性不育疾病基因研究的主要技术。其中Sanger测序是2010年使用的主要工具（82%），但此后使用率下降至2019年的26%。同一时期基于NGS的技术发展成为目前最常用的工具(61%)。

图过去十年中已发表男性不育的研究中使用遗传工具数量明细表

在精子鞭毛形态异常(MMAF)等方面，外显子组测序在少数患者中应用的非常成功，目前已鉴定出许多重要新发现的隐性疾病基因。外显子组测序也成功应用于识别无头精子患者的致病基因，特别是睾丸特异性基因BRDT、SUN5和PMFBP1的纯合和复合杂合突变，可破坏精子头部与鞭毛的连接。此外，NGS还有助于研究先天性孤立性促性腺功能减退症（特点是青春期发育不完全和不孕）。在导致促性腺激素释放激素（GnRH）神经元迁移的神经发育缺陷或扰乱神经内分泌GnRH分泌的作用基因已发现大量致病性突变。

由于高遗传异质性导致了表型的多样性，从生殖细胞完全缺乏（唯支持细胞综合征）到各种形式的成熟阶段停滞，常见形式的非阻塞性无精症（non-obstructiveazoospermia，NOA）的遗传学机制研究较为困难。尽管如此目前在这方面已经取得了重大进展，其中无精症男性的外显子组测序在近亲和非近亲家族中提示了TEX15、FANCM、XRCC2、MEIOB、FANCA、ADGRG2等基因的致病突变。然而现阶段许多新的候选基因功能尚未被验证，因此其在精子数量缺陷中的作用仍有待确定。

4、不育候选基因的临床有效性评估

前面叙述了多种用于识别与男性不育相关的遗传变异的方法。然而为更加具有说服力的将某一特定基因变异与疾病联系起来需考虑各种水平的证据。关于基因在造成精子数量或质量缺陷方面的作用，错误和误导性结论可能导致不适当的诊断。此外，错误的基因特征可能会污染候选疾病基因列表和途径分析，阻碍后续研究。因此有效鉴定参与男性不育症基因，尤其是识别证据不足、不确定和低质量的变异是十分重要的。近期对男性不育症基因-疾病关系的所有证据进行了系统的临床有效性评估。基于之前所发表的方法有92个基因被归类为与人类男性不育表型中度相关，这只包含了当时男性不育中所描述的521种基因-疾病关系中的18%。在未来的几年里随着NGS方法变得更加广泛频繁的使用，男性不育相关新基因发现的数量有望迅速增加。因此持续性的发现并定期重新评估所描述所有基因的遗传和功能证据是十分必要的。

5、功能验证的最新发展

功能验证实验的正确设计、对先前开发男性不育表型功能模型的依赖，使对新发现变异的验证工作至关重要。基因编辑技术的出现、用于精子发生研究的新型模式生物和体外系统实验将继续增强执行功能验证关键步骤的能力。

图功能验证技术对男性不育研究中的实例

在许多疾病中体外建模已被广泛使用，且在筛选多个基因的大量变异方面非常有效。此外在许多情况下可以从携带特定变体的个体进行体外建模，从而能够直接评估变异的功能影响。然而迄今为止尽管作出了很多努力，人类体外精子发生系统研究仍然十分困难。培养和维持人类睾丸组织功能的方法在未来可使新变异的功能验证成为可能，并可能使导致无精症变异的修饰成为可能，在不久的将来可使患者恢复生精能力。

虽然应用于男性不育研究的体外系统还不完善，但基因编辑工具在多种模型生物中的应用已证明导致不育变异功能验证方面可能是有效的，如在小鼠体内的N-乙基-N-亚硝基脲（ENS）是一种烷基化剂，可在随机位点诱导全基因组突变，已成功用于鉴定男性生育所需的新基因。在ENU随机突变后，表现出不育表型的小鼠随后通过多种方法进行筛选，包括选择性育种、连锁分析及全基因组测序，确定潜在的生殖缺陷突变。

在已经确定候选变异并需要功能验证的情况下，目前有多种有针对性的研究方法可以使用，包括利用吗啉寡核苷酸短期抑制基因活性、锌指核酸酶（ZFN）、转录激活物样效应器核酸酶（TALEN）以及聚集的规则间隔短回文重复序列（CRISPR），通过引入提前终止密码子或移码突变，进行基因组修饰使基因失活。另外这些方法可用于重现特定突变，如预测为致病性的错义突变。虽然所有工具都已成功应用于男性不育研究，但CRISPR在成本、效率和操作简单方面的优势使该基因编辑技术成为大多数当代研究的首选工具，其在男性不育研究中的应用在未来几年也将迅速扩大。

在早期的研究中，小鼠敲除实验对于鉴定人类男性不育基因的有着巨大价值，如对小鼠Klhl10基因的研究表明，Klhl10基因对小鼠的精子发生至关重要，从而激发了对人类男性不育的研究，鉴定出了为数不多的常染色体显性男性不育基因之一。对从不育和健康男性精子中分离的RNA进行逆转录PCR后，通过Sanger测序在严重少精症患者中鉴定出两个致病性KLHL10基因突变，一个错义突变和一个剪接突变。其中一名有生育能力的男子被发现携带了其中的错义突变，提示变异可能存在外显率情况。另一个例子是hsf2，最初发现其调节小鼠的正常精子发生，直到后来通过对该基因和约600个其他不育候选基因靶向NGS测序，在不育男性中发现了人类同源基因HSF2的显性杂合突变。

斑马鱼越来越多地被用来模拟人类疾病，包括不孕症。Lin等使用斑马鱼模型和Crispr/Cas9表明，amh基因对于控制雄性生殖细胞增殖和分化之间的平衡至关重要。最近CRISPR技术被用于系统地描述17个范可尼贫血(FA)基因的功能，揭示了其在生长、性发育和生育方面的重要作用。此类研究成果对于男性不育相关基因的临床有效性评估至关重要，为最近发现的基因突变在无精症男性中的作用提供了额外证据。

使用甲基磺酸乙酯诱导突变对果蝇进行高通量筛选，类似于小鼠的ENU方法或最近的RNA干扰（RNAi）敲除，可在单个实验中有效识别候选不育基因并对多个候选基因进行下游功能评估。如boule(与人类DAZ同源)在减数分裂中作用的发现，最初是在果蝇的大规模突变筛选中发现。

最后有鞭毛和纤毛的单细胞生物，包括衣藻、锥虫和四膜虫，已被用于研究MMAF患者精子鞭毛形成和功能相关基因突变（如CFAP43、CFAP44、ODA7、SPAG16L和WDR66）的功能研究。酵母同样是研究减数分裂的重要模式生物，能够识别与男性不育相关的新基因，如gda1的人类同源基因ENTPD6。在这些模式生物中使用基因编辑工具将继续对识别表征与男性不育相关的遗传变异具有重要意义。

未来：克服当前局限，提高生物学理解、患者诊断和预后

无偏倚的NGS方法的引入彻底改变了许多疾病遗传原因的识别方式。尽管这些方法在研究实验室中经常用于研究男性不育症，但尚未鉴定出引起该疾病的大多数基因。对于DFS-MMAF、无头精子综合症和小精子症等几种男性不育症，目前基于已知遗传原因的诊断率约为50％。相比之下，最常见的男性不育如无精症和少精症的诊断率仍然非常有限。鉴于新基因组技术在研究和诊断方面的巨大潜力，如何能最有效的提高对男性不育遗传学的理解是需要考虑和努力的。作者讨论了当前方法的局限性，以及基因组技术的一些重要进展，这些改进应有助于提高对疾病基因的识别的效率。

1、相对常见的异质性疾病中基因发现的挑战

对于外显子组，尤其是全基因组测序，使我们能够进行无偏倚的遗传学研究有助于鉴定新的疾病基因或基因组区域。然而发现不育基因的能力仍受到许多实验设计因素的严重影响，谨慎的选择表型和队列至关重要。此外了解疾病的遗传结构对于设计合适的实验也很重要。如前所述离散的精子形态异常预计涉及较少基因，生精失败的表型可能来自数百甚至数千个基因中任何一个基因的变异。在具有离散表型的情况下，因变异可能会定位到较少基因，少病例/对照设计更为合适。近亲家庭遗传研究已被证明是一种有效的研究方法，可识别导致精子质量缺陷的罕见男性不育基因。在有血缘关系的情况下，数据分析可集中在纯合基因组区域，因在近亲家族中罕见的隐性致病突变可能会更频繁的以纯合状态存在。

在对非亲缘群体中NOA的调查中，考虑到疾病对整体适应度的影响，在患者群体中个体基因极有可能以极低的频率携带致病变异。在这种情况下，如其他遗传异质性疾病所显示的那样，大量的患者和对照组队列以及稳健的统计方法对于识别受影响患者基因组中突变负荷增加的基因至关重要。这就需要进行大规模的合作研究和广泛的数据共享，以可靠、稳健地识别和功能验证发现新的男性不育基因。

最近在雄性不育遗传学领域建立了国际联盟以促进这一发展，包括GEMINI联盟（https://gemini.conradlab.org/）和IMIGC联盟（https://www.imigc.org/）。这些联盟内外的合作对于识别复发突变基因、研究详细的临床表现、进行相关功能研究以确认某些突变的致病性、揭示潜在的生物学机制等方面至关重要。此外这些联合体可以帮助复制单一病例观察结果，确认或质疑新候选基因在不育症中的作用，建立临床指南，帮助改进遗传诊断。在男性不育领域，研究合作的增加可以成为一个推动因素，既有利于我们的生物学理解，也有利于患者诊断。

2、确定遗传和新生突变在不孕症中的作用

到目前为止大多数研究都集中在研究常染色体隐性或X/Y连锁形式的男性不育。严重的男性不育不能由父亲遗传，可以由母亲遗传，也可为合子后新生突变或CNVs引起。患者-父母三人外显子组和基因组测序揭示了新生种系突变在许多散发遗传疾病中的重要性，特别是在智力残疾和相关疾病中。这是一种非常有效的识别新疾病基因的方法，在男性不育研究中应用的主要挑战之一是通常无法获得父母的DNA样本。而最近有几个研究小组已经开始为男性不育症基因研究组建患者-父母三人检测模式，旨在鉴定引起男性不育症的新发突变，并增加对亲本遗传模式的理解。

3、全面概述男性不育的所有基因组变异

大多数NGS方法使用短读测序，这限制了重复结构、高度同源序列和结构变异的检测。考虑到Y染色体中存在高度同源区域和重复区域，和其在染色体微缺失以及其他基因组区域中结构变异的重要性，将对男性不育研究产生重大影响。最近出现了新的测序平台，将测序读取长度从几百个核苷酸增加到10kb甚至更长，阅读长度增加，这些平台将能更好地检测重复扩增、同源序列和结构基因组变异，但目前这些技术检测碱基精度和成本还不能与短读测序方法相比。因此目前尚不能在单一实验中可靠且经济的确定不育患者基因组中存在的所有遗传变异。而在未来十年内，完整、准确和廉价的人类基因组测序可能会面世，男性不育的主要挑战不再是检测，而将是对变异解读。

目前对男性不育的遗传学理解方面已经取得了重大进展。利用多种基因组技术在很大程度上已经可以定性的鉴定出罕见精子缺陷基因，并开发出具有高诊断率的NGS基因Panel进行应用。对更常见的定量精子缺陷遗传学基础的理解和进展并不像在定性精子缺陷或其他遗传疾病中发展的迅速。随着资金较为雄厚的大型联合研究组织使用无偏倚基因组学方法对数千名患者进行研究，并对相关功能验证分析，对于男性不育基因研究将未来几年取得重大突破。

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