一、实验原理：

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)或者ＥＢ类似物，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。

一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：超螺旋DNA>线性DNA>开环DNA

正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

Marker的选择DNA电泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。

二、设备：

移液器，微波炉，电泳仪电源，水平式凝胶电泳槽，样品梳，电子秤，锥形瓶，凝胶成像系统，烧杯，量筒

三、耗材：

PCR产物，质粒，枪头

四、试剂：

1.150×TAE缓冲液：取242gTris碱于1L烧杯中，加入57.1ml的冰醋酸，100ml的0.5mol/LEDTA（pH8.0），加入去离子水定容到1L。取2ml50×TAE缓冲液加入98ml去离子水配成100ml1×TAE稀释缓冲液备用。

2.21.5%琼脂糖

3.3DNA相对分子质量标准样品：DL2000。

4.4Goldview溶液：一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，3μl/100ml胶。

5.56×上样缓冲液：商品化产品，贮存于4℃。

五、实验步骤：

1．制备胶液：锥形瓶中的0.75g琼脂糖与50ml1×TAE稀释缓冲液混匀后放入微波炉里加热至琼脂糖完全融化，取出摇匀。

2．制备胶板：将胶槽置于水平支持物上，插入样品梳，注意梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙；琼脂糖溶液中加入1.5μlGoldview溶液使其终浓度为3μl/100ml胶；将琼脂糖小心倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拔出梳子，注意不要损失梳子底部的凝胶，然后向槽内加入1×TAE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板表面。

3．加样：取25μlDNA样品（PCR产物中含有染液），用移液器小心加入样品槽中。每加完一个样品要用电泳槽中的buffer清洗枪头，上样时要小心不要将样品槽底部凝胶刺穿，同时将10μl的DL2000点样，记录点样顺序。

4．电泳：加完样后，合上电泳槽盖，连接好电线和电源，注意正负极，接通电源。恒压100V，待阴极有气泡冒出才能离开。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。

5．观察：戴好手套小心取出电泳槽，滑出凝胶，放在一次性手套上，置于凝胶成像系统下观察，拍照。

6．清洁：电泳用具，晾干。

六、注意事项

1.Marker的选择

Marker的选择要适中，Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。如果marker太大就可能跑不开，挤到一起，起不到marker的作用。

2.煮胶要完全，胶要摇匀

注意煮胶完全，不然有小颗粒会影响跑胶结果。如果胶没有摇匀，跑胶的时候，相同的DNA的速度就不会相同，这样会出现弥散条带。

3.电泳跑完后，怎样看跑胶效果？

先看marker跑的怎样，如果marker跑的很好，没有弯曲，就说明整个电泳体系是没有问题的。

4.点样时别锉到胶。

5.条带模糊暗淡

电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，一般用2～3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。如果是EB染色，可能是溴化乙锭见光易分解，母液配制时间过长或保存不当(一般4℃避光保存一年内有效)，或者终浓度没达到0．5vg／ml

七、讨论

1.关于凝胶浓度的选择

琼脂浓度（%）

DNA相对分子质量（Kb）

0.3

5——60

0.6

1——20

0.7

0.8——1.0

0.9

0.5——7

1.2

0.4——6

1.5

0.2——3

0.1——2

2.跑胶时候。接近阴极的地方胶发黑？

ＴＡＥ的浓度太低，或者是误把水当成TAE，水不能导电，致使负极的胶碳化。

3加样时候，样品浮在缓冲液中，不能沉在加样孔里？

Loadingbuffer里的甘油浓度太低，又或者根本没加甘油。

八、琼脂糖凝胶电泳常见问题

常见问题

DNA条带模糊

DNA降解

实验过程避免核酸酶污染

电泳缓冲液陈旧

电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。TBE建议使用10次就更换缓冲液

所用电泳条件不合适

电泳时电压不应超过20V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换

DNA上样量过多

减少凝胶中DNA上样量

DNA含盐过高

电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分

有蛋白污染

电泳前酚抽提去除蛋白

DNA变性

电泳前勿加热，用20mMNacl缓冲液稀释DNA

出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。

不规则DNA带迁移

电泳条件不合适

电泳时电压不应超过20V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换

DNA变性

电泳前勿加热，用20mMNacl缓冲液稀释DNA

带弱或无DNA带

DNA上样量不够

增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低

DNA降解

实验过程避免核酸酶污染

DNA跑出凝胶

缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度

EB染色的DNA，所用光源不合适

应用短波长（254nm）的紫外光源

DNA带缺失

DNA跑出凝胶

缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度

分子大小相近的DNA带不易分辨

增加电泳时间，核准正确凝胶浓度

DNA变性

电泳前勿加热，用20mMNacl缓冲液稀释DNA

DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适

在脉冲凝胶电泳上分析

电泳时Ladder扭曲

配胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配置

同时配置，电泳缓冲液高出液面1-2mm即可

电泳时电压过高

电泳时电压不应超过20V/CM

[于轹文、王楠]

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