本文选自北京中医药大学学报2021年第44卷第6期

作者：

冯雪枫，李慢中，詹宇，杨乐，陆允，李明聪，赵晖

引用：

冯雪枫，李慢中，詹宇等.补阳还五汤促进脑缺血大鼠脑组织微结构重塑的作用[J].北京中医药大学学报,2021,44(6):500-509.

摘要：

目的：

研究补阳还五汤改善脑缺血大鼠脑血流灌注、促进轴突生长及微结构重塑的药理作用及机制。

方法：

线栓法制备右侧大脑中动脉栓塞脑缺血大鼠模型。将雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和补阳还五汤组(16.1g/kg),连续灌胃15d后取材并检测指标。T2加权成像检测脑梗死体积；动脉自旋标记检测损伤脑区的血流灌注；弥散张量成像检测损伤脑区的超微结构。HE染色观察损伤脑区的病理损伤；免疫荧光染色法检测淀粉样前体蛋白(APP)、神经轴突生长抑制因子(NogoA)和神经轴突生长抑制因子受体(NgR)的蛋白表达，RT-PCR法检测生长相关蛋白-43(GAP-43)、NogoA和NgR的基因水平，以评价脑缺血大鼠轴突的生长及损伤情况。

结果：

MRI结果显示，与模型组比较，补阳还五汤组大鼠的脑梗死体积减小(P<0.05),梗死核心及周围皮层的血流灌注增加(P<0.05),梗死灶周围皮层的超微结构改善。HE染色结果显示，补阳还五汤组大鼠较模型组皮层正常形态神经细胞数量增加，异常形态神经细胞数量减少(P<0.01或P<0.05),水肿程度减轻，神经纤维致密性提高。免疫荧光染色结果显示，补阳还五汤组大鼠较模型组梗死灶周围皮层及内囊APP、NogoA蛋白的阳性表达降低(P<0.05或P<0.01),内囊NgR蛋白阳性表达降低(P<0.05)。RT-PCR结果显示，补阳还五汤可下调梗死灶周围皮层NogoA、NgR基因表达水平(P<0.05或P<0.01)。

结论：

补阳还五汤能够有效减小脑缺血大鼠的梗死体积，改善脑血流灌注和脑组织微结构，减轻神经细胞损伤，促进轴突生长及微结构重塑。

关键词：

补阳还五汤；脑缺血；脑灌注；神经细胞；轴突生长；大鼠

脑缺血又称缺血性脑卒中，是由脑供血动脉狭窄或闭塞，脑血管血流量降低甚至闭塞所致的脑组织损伤、坏死，可引起多种病症，具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点，对人类健康危害性极大。近年研究发现，脑缺血会引发以轴突损伤、髓鞘脱失为典型病理特征的白质损伤，因此治疗时应在提高血流灌注、保护神经元的同时促进轴突修复及结构功能重塑。

补阳还五汤出自清代医家王清任《医林改错》,由黄芪、赤芍、川芎、当归、地龙、桃仁和红花共7味药组成，具有补气活血通络的功效，在临床上治疗脑缺血取得显著疗效。为进一步明确补阳还五汤改善脑缺血损伤的作用及机制，本课题组基于多模态磁共振成像(magneticresonanceimaging,MRI)技术，结合神经病理学检测研究补阳还五汤减轻脑缺血大鼠神经元损伤、提高血流灌注、改善脑组织超微结构及促进轴突微结构重塑的药理作用，现报告如下。

1材料

1.1动物

SPF级雄性SD大鼠22只，8周龄，体质量280～300g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0011,饲养于首都医科大学实验动物中心国家标准实验室，动物实验设施许可证号：SYXK(京)2018-0003。独立通风系统，自然昼夜循环，维持温度18～22℃,相对湿度40%～60%,自由饮食和饮水。适应环境1周后进行实验。

1.2伦理审查

实验过程符合国家动物伦理相关规定，经首都医科大学实验动物伦理委员会审核批准，编号：AEEI-2018-052。

1.3药物

补阳还五汤(生黄芪120g,当归尾3g,赤芍5g,地龙3g,川芎3g,红花3g,桃仁3g)中药饮片购自北京同仁堂药店。由本实验室按常规方法浸泡，煎煮2次，合并滤液，浓缩至含生药3g/mL。4℃保存备用。

1.4主要仪器与试剂

70/16US小动物核磁影像系统(德国Bruker公司),Model1025核磁兼容动物监护和数据系统(美国SAII公司),VT-110-MRI小动物麻醉机(美国JDMedical公司),5810R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司),RM2255石蜡切片机(德国Leica公司),Eclipse80i光学显微镜(日本Nikon公司),NIS-ElementsBasicResearch图像采集分析系统(日本Nikon公司),6325YM002661梯度PCR仪(德国Eppendorf公司),788BR04980荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

羊血清(北京中杉金桥有限公司，批号：ZLI-9021),RNAprepPureTissueKit动物组织总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，批号：DP431),FastQuantRTKit(withgDNase)(天根生化科技有限公司，批号：KR106),SuperRealPreMixPlus(SYBRGreen)荧光定量预混试剂增强版(天根生化科技有限公司，批号：FP215),小鼠抗淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)(Millipore公司，批号：1991263),兔抗神经轴突生长抑制因子(NogoA)(Abcam公司，批号：ab62024),兔抗神经轴突生长抑制因子受体(NgR)(Abcam公司，批号：ab26291)。β-actin、生长相关蛋白-43(Growthassociatedprotein-43,GAP-43)、NogoA和NgR引物均由Takara公司合成。

2方法

2.1造模

参照文献，利用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)局灶性脑缺血模型。大鼠吸入异氟烷麻醉后于仰卧位固定，将尼龙栓线(直径0.265mm)推入右侧颈内动脉16～18mm处，结扎动脉残端，缝合皮肤。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分支，不闭塞大脑中动脉。术中、术后室温控制在24～25℃,大鼠体温维持在36.5～37.5℃。待大鼠麻醉清醒后进行神经行为学观察，参照文献,将具有“提尾时左侧前肢不能伸直、行走时向左侧旋转或侧倾”神经功能症状的大鼠纳入实验对象。

2.2分组与给药

采用随机数字表法将22只SD雄性大鼠随机分为假手术组6只、模型组8只、补阳还五汤组8只。按体表面积折算，术后24h补阳还五汤组大鼠每天灌胃补阳还五汤等效剂量16.1g/kg,每日1次；假手术组和模型组大鼠等容量生理盐水灌胃，每日1次。连续灌胃15d后磁共振成像扫描和组织取材检测。

2.3磁共振成像

2.3.1T2加权成像

采用核磁影像系统水平扫描，于感兴趣区域定量分析脑缺血大鼠的梗死体积。异氟烷和氧气混合气体麻醉大鼠后俯卧位置于扫描床，头部固定。T2加权成像(T2-weightedimaging,T2WI)采用快速自旋回波(turbospinecho,TSE)序列。参照文献，利用ImageJ软件对T2WI图像进行分析处理，分别在每个冠状面手动勾画缺血梗死区域，统计右侧(缺血侧)和左侧(健侧)梗死体积。计算脑梗死体积。脑梗死体积(mm

)=每个断层面梗死面积之和(mm

)×层厚(mm)。

2.3.2动脉自旋标记

动脉自旋标记(arterialspinlabeling,ASL)采用流动敏感反转恢复序列-平面回波成像序列，利用Paravisionversion5.1软件分析处理获取脑血流(cerebralbloodflow,CBF)图，在右侧选择感兴趣区域(梗死核心、梗死灶周围皮层),以冠状位中线为中轴，在左侧选择各对应区域，参照文献分析CBF数据，计算相对脑血流量值(relativeCBF,rCBF)。rCBF=右侧CBF/左侧CBF。

2.3.3弥散张量成像

弥散张量成像(diffusiontensorimaging,DTI)采用单次轴向自旋回波序列，利用Paravisionversion5.1软件对数据进行重构，获取部分各向异性(fractionalanisotropy,FA)图像。分别在FA图像上选取双侧灰质脑区梗死灶周围皮层及白质脑区内囊为感兴趣区域，获取DTI参数值FA。计算相对FA值(relativeFA,rFA)。rFA=右侧FA/左侧FA。

2.4取材

各组动物麻醉后，用300mL生理盐水快速灌注冲洗左心室，4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)300mL心内灌注先快速后慢速固定，恒定灌注45min。充分固定后开颅取脑，切取视交叉后组织块(长4mm、宽1.5cm、厚4mm),4℃固定1周后，常规石蜡包埋，连续切取4μm冠状切片。

2.5HE染色

石蜡切片经二甲苯脱蜡，浓度梯度乙醇至水；苏木素染色浸泡25min后水洗，盐酸乙醇分化30s;水浸15min;0.5%伊红染液浸2min,水洗；经乙醇、二甲苯石碳酸及二甲苯常规脱水后，中性树脂封片。光学显微镜(20倍)扫描，利用软件Caseviewer观察脑组织的病理形态，在缺血侧的梗死灶周围皮层获取3张不重叠视野(40倍),利用软件ImageJ对各视野下正常、异常神经细胞进行计数，参照文献计算神经细胞密度。神经细胞密度(个/mm

)=神经细胞数量(个)/视野面积(mm

2.6免疫荧光染色

石蜡切片经60℃过夜烘烤后脱蜡水化，0.01mol/LPBS洗涤25min,0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.02)修复抗原20min后，10%羊血清37℃封闭1h,4℃一抗孵育APP(1∶100)、NogoA(1∶300)和NgR(1∶200)48h。37℃复温30min后，0.01mol/LPBS洗涤15min,孵育反应增强液2(37℃,1h),0.01mol/LPBS洗涤15min后用DAB染色，染色时间分别为1、1、8min,立即置于蒸馏水中终止染色，DAPI封片。显微镜观察免疫荧光染色切片，APP、NogoA和NgR的阳性表达呈棕黄色；采集每张切片梗死灶周围皮层和内囊互不重叠的3个视野，利用NIS-ElementsBasicResearch图像采集分析系统统计APP、NogoA和NgR的积分光密度以定量反映表达水平。

2.7RT-PCR

按照试剂盒操作说明提取大鼠脑缺血边缘组织总RNA,进行RNA纯度鉴定。以提取的总RNA为模板，按试剂盒操作说明逆转录合成cDNA。应用RT-PCR方法测定GAP-43、NogoA和NgR基因表达水平。引物序列如下：β-actin:正向引物5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′,反向引物5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′,扩增长度150bp;GAP-43:正向引物5′-CACCATGCTGTGCTGTATGAGAA-3′,反向引物5′-GTCCACGGAAGCTAGCCTGA-3′,扩增长度137bp;NogoA:正向引物5′-CTTGGTCATGTGAACAGCACAATAA-3′,反向引物5′-CATTGAACAAGGCACCAACGTAA-3′,扩增长度124bp;NgR:正向引物5′-TCCAGTCATGCCGAAATCTCAC-3′,反向引物5′-TGGTAGGGTCCACGACATGAAG-3′,扩增长度144bp。PCR扩增条件：95℃15min预变性→40个循环(95℃10s变性→52℃31s退火→72℃30s)。采用2

法计算目的基因的相对表达量。

2.8统计方法

采用SPSS26.0软件进行数据处理，符合正态分布的计量资料以均值±标准差(x±s)表示。对数据进行方差齐性检验，方差齐则采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；方差不齐则采用Tamhane’sT2(M)检验。不符合正态分布的数据用中位数(四分位区间)[Md(P

)]表示，采用非参数秩和检验。对梗死体积和梗死核心的rCBF值进行独立样本t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

3.1补阳还五汤对脑缺血大鼠梗死体积的影响

冠状位T2WI图像显示，假手术组大鼠脑组织结构完整清晰，无异常信号；模型组大鼠右侧大脑中动脉供血脑区呈现出异常高信号；补阳还五汤组大鼠脑组织异常高信号区较模型组缩小。见图1。模型组脑梗死体积(224.99±45.77)mm

,补阳还五汤组脑梗死体积(121.24±93.68)mm

,差异有统计学意义(t=6.886,P=0.020)。

3.2补阳还五汤对脑缺血大鼠脑血流灌注的影响

利用ASL监测大鼠脑血流，CBF图像显示假手术组大鼠双侧半脑血流分布对称，rCBF值约为1。模型组与假手术组比较，梗死灶周围皮层rCBF值降低(P<0.01),补阳还五汤组大鼠梗死核心及梗死灶周围皮层rCBF较模型组提高(P<0.05)。结果见表1、图2。

3.3补阳还五汤对脑缺血大鼠脑组织微结构损伤及修复的影响

利用DTI监测并评价大鼠脑组织的微结构变化，结果显示，假手术组大鼠灰白质结构清晰，无异常信号，DTI参数相对FA值接近1,表明左右半脑组织对称。模型组大鼠FA图像缺血侧出现异常低信号，梗死灶周围皮层和内囊的rFA值较假手术组降低(P<0.01);与模型组相比，补阳还五汤组大鼠梗死灶周围皮层rFA值提高(P<0.05)。结果见表2、图3。

3.4补阳还五汤对脑缺血大鼠神经病理学的影响

HE染色结果显示，假手术组大鼠皮层的神经细胞形态完整，模型组大鼠的梗死灶周围皮层的血管出现水肿，神经细胞发生固缩、浓染、水肿及破裂，形态正常的神经细胞密度较假手术组减少(P<0.01),而异常形态的神经细胞密度增加(P<0.01);与模型组相比，补阳还五汤组大鼠梗死灶周围皮层血管、神经细胞的水肿情况改善，形态正常的神经细胞密度增加(P<0.05),形态异常的神经细胞密度减少(P<0.01)。结果见表3、图4。

3.5补阳还五汤对脑缺血大鼠轴突损伤的影响

免疫荧光结果显示，模型组大鼠较假手术组梗死灶周围皮层、内囊的APP蛋白表达增加(P<0.01或P<0.05);补阳还五汤组脑缺血大鼠梗死灶周围皮层及内囊的APP的表达较模型组降低(P<0.01或P<0.05)。结果见表4、图5。

3.6补阳还五汤对脑缺血大鼠轴突生长的影响

RT-PCR结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠梗死灶周围皮层NogoA和NgR基因表达水平升高(P<0.05或P<0.01);补阳还五汤组大鼠梗死灶周围皮层NogoA和NgR基因表达水平较模型组降低(P<0.05或P<0.01)。结果见表5。

免疫荧光结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠梗死灶周围皮层、内囊NogoA和NgR蛋白阳性表达水平增加(P<0.05或P<0.01);与模型组相比，补阳还五汤组大鼠梗死灶周围皮层NogoA、内囊NogoA和NgR蛋白表达水平降低(P<0.01或P<0.05)。结果见表6、图6。

4讨论

缺血性脑卒中的发病机理涉及脑组织能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸毒性、自由基损伤、钙超载、神经细胞凋亡等多个环节。缺血性脑卒中发生后，脑血流供应减少，能量代谢出现障碍，最终导致组织软化坏死即脑梗死。而以神经元胞体、树突和突触等灰质细胞结构的受体或通道为靶点的神经保护药物临床效果不佳，其主要原因是忽略了对白质的保护。脑白质由脑内深部穿支动脉供血，侧支循环少，脑缺血可引发广泛性或多灶性白质损伤，以髓鞘脱失、轴突损伤为典型病理特征。因此，在提高脑血流灌注、保护神经元的同时，减轻白质脑区的病理损伤，促进轴突结构重塑、髓鞘损伤修复和神经纤维保护，可协助对受损灰质的治疗，进一步改善脑梗死病变、恢复神经功能，对卒中病人的康复具有重要的临床意义。

补阳还五汤是中医临床上治疗脑缺血及其后遗症的常用方，出自清代医家王清任《医林改错》,是益气活血的代表方剂，前期研究发现补阳还五汤能促进脑缺血后神经发生、血管生成和神经功能恢复。本研究结合MRI技术和神经病理学检测，探究并分析补阳还五汤对脑缺血恢复期大鼠脑结构和功能的改变。

MRI具有高场强、高空间分辨率的特点，能够检测到动物脑组织结构及功能变化情况。T2WI通过检测组织的T2横向弛豫时间反映不同组织的解剖结构特征。由于脑梗死区域会聚集大量水分子，组织中游离水含量增加，T2横向弛豫时间延长，在T2WI中表现为高信号，因此T2WI可以无创监测脑梗死的变化。T2WI图像分析显示脑缺血大鼠缺血侧皮层出现异常高亮信号，提示中动脉供血区的缺血梗死灶明显，补阳还五汤治疗15d后，脑缺血大鼠的梗死体积减小。ASL通过脉冲序列标记流入组织的血液质子，检测脑组织的血流灌注变化。ASL成像结果显示脑缺血大鼠缺血脑区的血流量降低，补阳还五汤能增加梗死核心及周围皮层的血流灌注。相关研究表明，补阳还五汤可增加局灶性脑缺血大鼠缺血周边区微血管密度、上调血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的基因和蛋白表达，促进血管新生，增加脑血流量、改善脑侧支循环。DTI技术通过测量水分子的布朗运动，无创监测神经纤维的方向性和完整性，描述脑梗死后脑组织微结构的变化。DTI成像常用参数FA指水分子各向异性成分占弥散张量的比例，正常脑组织神经纤维内的水分子因受到髓鞘的约束，沿轴突进行定向运动，当脑缺血发生时，轴突损伤导致水分子的各向异性运动变为各向同性运动，则FA值减小。脑缺血15d大鼠梗死灶皮层和内囊的rFA值降低，补阳还五汤组大鼠梗死灶周围皮层rFA值升高，提示髓鞘结构改善、白质完整性增强，补阳还五汤能够促进脑缺血损伤后的组织微结构修复。

本实验利用HE染色观察脑缺血大鼠脑组织病理变化，发现其梗死灶周围皮层正常形态的神经细胞明显减少，形态异常的神经细胞表现为固缩、浓染、水肿及破裂；经补阳还五汤治疗15d后，形态异常的神经细胞减少，水肿、破裂情况改善，正常形态的神经细胞增多，直观反映了补阳还五汤对脑缺血大鼠神经细胞的保护作用。

生长相关蛋白-43(GAP-43)是与神经发育、轴突重塑等环节密切相关的快速转运胞膜磷酸蛋白，能够通过促进肌动蛋白聚集，增强生长锥的活力，从而促进神经轴突的生长、分化及再生，增强神经可塑性。本研究发现补阳还五汤上调脑缺血大鼠损伤皮层的GAP-43基因表达，提示其对轴突生长发挥积极作用。据文献报道，急性脑梗死小鼠缺血半暗带内的神经元再生也会伴随GAP-43蛋白的高表达。当缺血、缺氧等刺激引发脑损伤后，轴突的细胞骨架崩解，由高尔基体产生的轴浆转运蛋白——淀粉样前体蛋白(APP)作为反应性蛋白迅速大量表达、异常积聚，补阳还五汤能够抑制皮层和内囊APP过表达的病理状态，减轻脑缺血大鼠的轴突损伤。脑缺血15d处于早期慢性发病阶段，机体的神经修复进程全面启动，梗死灶边缘区周围神经再生加快，随着少突胶质细胞迅速增生并过度活化，轴突生长抑制因子(NogoA)蛋白大量释放，阻碍轴突再生进程。NogoA与其受体NgR结合可激活细胞内的RhoA-ROCK信号通路，调节生长锥中的微丝使其崩解，抑制轴突再生。免疫组化实验证明脑缺血大鼠梗死灶周围皮层和内囊的NogoA、NgR阳性表达增加，RT-PCR验证二者基因水平均上调，而补阳还五汤能够抑制NogoA和NgR表达，据文献报道称其能进一步减轻受损神经元的继发性损伤从而改善神经功能。上述结果提示补阳还五汤能够有效拮抗脑缺血所致的轴突损伤及生长抑制，促进脑内轴突生长和白质微结构重塑。

综上，本研究基于磁共振成像技术结合神经病理学检测，证实补阳还五汤能够减轻神经细胞和轴突损伤，有效改善脑缺血大鼠的脑梗死、脑血流灌注和脑组织微结构，为临床治疗脑卒中提供了实验基础。

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